Para evitar la contaminación cruzada durante la operación, los requisitos principales para su diseño, construcción y gestión de la operación son:
1. El diseño y la construcción del laboratorio, el sistema de trabajo seguro o los procedimientos operativos estándar de seguridad deberán cumplir con los requisitos del&actual; Requisitos generales para el&de bioseguridad del laboratorio; GB19489.
2. La PCR se divide en cuatro áreas funcionales de acuerdo con los pasos de trabajo, a saber, área de almacenamiento y preparación de reactivos, área de preparación de muestras, área de amplificación y área de análisis del producto de amplificación. Si se equipa un instrumento de PCR fluorescente en tiempo real, se pueden combinar las áreas de amplificación y análisis del producto. Cada área funcional debe estar claramente marcada, y los equipos y artículos en diferentes áreas funcionales no deben mezclarse.
La dirección del flujo de aire del laboratorio de PCR se puede realizar de acuerdo con el área de almacenamiento y preparación de reactivos → área de preparación de muestras → área de amplificación → área de análisis de producto amplificado para evitar que los productos amplificados entren en el área preamplificada junto con el flujo de aire. Se puede llevar a cabo disminuyendo la presión del aire del área de almacenamiento y preparación de reactivos → área de preparación de muestras → área de amplificación → área de análisis del producto de amplificación. Se puede lograr instalando ventiladores de escape, dispositivos de escape de presión negativa u otros métodos factibles.
3. El ingreso a cada área de trabajo debe seguir estrictamente una sola dirección, es decir, área de almacenamiento y preparación de reactivos → área de preparación de muestras → área de amplificación → área de análisis del producto de amplificación. Se deben usar diferentes áreas de trabajo (como diferentes colores). Los trabajadores no deberán sacar la ropa de trabajo cuando abandonen cada área de trabajo.
4. La limpieza del laboratorio debe realizarse en la dirección del área de almacenamiento y preparación de reactivos → área de preparación de muestras → área de amplificación → área de análisis del producto amplificado. Las diferentes áreas experimentales deben tener sus propios aparatos de limpieza para evitar la contaminación cruzada.
5. Una vez finalizado el trabajo, el área de trabajo debe limpiarse inmediatamente. La superficie del banco de laboratorio en el área de trabajo debe ser capaz de resistir los efectos de desinfección y limpieza de productos químicos como el hipoclorito de sodio. La irradiación ultravioleta en la superficie del banco de laboratorio debe ser conveniente y efectiva. Dado que la distancia y la energía de la irradiación ultravioleta son muy críticas para el efecto de descontaminación, se puede usar una lámpara ultravioleta móvil (longitud de onda de 254 nm) y, una vez completado el trabajo, se puede ajustar para irradiar dentro de 60-90 cm en la mesa experimental . Dado que el producto amplificado tiene solo unos pocos cientos o decenas de pares de bases (pb), no es sensible al daño de los rayos UV, por lo que el fragmento amplificado irradiado con rayos UV debe irradiarse durante más tiempo, preferiblemente durante la noche.
Las funciones del área de almacenamiento y preparación de reactivos son: la preparación de reactivos de almacenamiento, la dispensación de reactivos y la preparación de la mezcla de reacción de amplificación, así como el almacenamiento y preparación de consumibles como tubos y puntas de centrífuga. Los materiales como los reactivos de almacenamiento y los consumibles utilizados para la preparación de muestras deben transportarse directamente al área de almacenamiento y preparación de reactivos, y no pueden pasar a través del área de detección de amplificación. Los materiales de control positivo y los materiales de control de calidad en el kit no deben almacenarse en esta área, sino que deben almacenarse en esta área. Área de procesamiento de muestras.
La función del área de preparación de muestras es: extracción de ácido nucleico (ARN, ADN), almacenamiento y adición al tubo de reacción de amplificación. Para las operaciones que involucran muestras clínicas, se deben cumplir los requisitos para equipos de protección, protección personal y especificaciones de operación para laboratorios secundarios de bioseguridad. Dado que la contaminación por aerosoles puede ocurrir durante la mezcla de muestras y la purificación de ácido nucleico, se pueden establecer condiciones de presión positiva en esta área para evitar la contaminación por aerosoles de las áreas vecinas. Para evitar la contaminación cruzada entre las muestras, después de agregar el ácido nucleico a analizar, se debe cubrir el tubo de reacción que contiene la mezcla de reacción. Para materiales potencialmente infecciosos, la tapa debe abrirse en el gabinete de seguridad biológica, y debe haber procedimientos claros para el manejo e inactivación de muestras.
La función de la zona de amplificación es: síntesis de ADN, amplificación y detección de ADN. Para evitar la contaminación causada por aerosoles, se debe minimizar caminar en el área. Cabe señalar que todos los tubos de reacción probados no deben abrirse en esta área.
La función del área de análisis del producto amplificado es: análisis y determinación adicionales de fragmentos amplificados, tales como hibridación, electroforesis de digestión enzimática, análisis de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante, secuenciación, etc. Los productos de amplificación de ácido nucleico tienen varios métodos de análisis, como métodos de hibridación de sonda. en membranas o en microplacas o chips (marcado de radionúclidos o marcado de nucleidos no radiactivos), electroforesis en gel de agarosa directa o digerida, electroforesis en gel de poliacrilamida, transferencia Southern, métodos de secuenciación de ácido nucleico, espectrometría de masas, etc.
El área de análisis del producto de amplificación es la principal fuente de contaminación del producto de amplificación en el laboratorio de PCR, por lo que se debe tener cuidado para evitar llevar el producto de amplificación a través de los artículos y la ropa de trabajo en esta área. Cuando se utiliza el método PCR-ELISA para detectar productos amplificados, se debe usar un lavador de placas para lavar las placas, y el líquido residual se debe recoger en 1 mol / L HCl, y no se puede verter en el laboratorio, pero se debe desechar. del laboratorio de PCR. Soltar. La punta usada también debe empaparse en 1 mol / L HCl y luego colocarse en una bolsa de basura para su eliminación de acuerdo con los procedimientos, como la incineración. Como esta área puede usar ciertas mutaciones genéticas y sustancias tóxicas como bromuro de etidio, acrilamida, formaldehído o radionúclidos, etc., se debe prestar atención a la protección de seguridad de los experimentadores.